Note publique d'information : Le phage display est une méthode généralement utilisée pour l'évolution dirigée de
protéines, elle permet de produire une immense diversité de variants de protéines
exprimés sur la membrane de particules virales. Ces variants de protéines peuvent
être sélectionnés soit pour leur affinité de liaison (p. ex. les anticorps) soit pour
leur activité catalytique (p.ex. les enzymes). La sélection d'enzymes pour leur activité
catalytique requiert néanmoins l'utilisation de substrats et/ou produits immobilisés,
ce qui empêche la sélection de protéines sur plusieurs cycles catalytiques. Le but
de ce projet de thèse était de développer une méthode nous permettant d'outrepasser
ces limites : la compartimentation dans des systèmes microfluidiques de particules
virales exprimant des variants de protéines unique sur leur surface. L'encapsulation
de ces particules dans des gouttes nous a permit d'utiliser des substrats/produits
solubles et donc la sélection pour de multiples cycles catalytiques a été possible.
L'utilisation d'un système d'expression mammifère a permit aux protéines de subir
les modifications post-traductionnelles (ponts disulfure, glycosylations) nécessaires.
Ce système permet de monitorer l'activité enzymatique, de variants de protéines uniques
d'une banque, exprimés sur la membrane de particules virales. En plus, nous avons
développé un système nous permettant de trier des virus en utilisant comme critère
la présence ou l'absence d'activité enzymatique.
Note publique d'information : Phage display is a widely used method for directed evolution of proteins, allowing
the generation of an enormous diversity of protein variants displayed on the viral
particles (library diversity <1012). These protein variants can then either be selected
for binding affinity (e.g. antibodies) or for catalytic activity (e.g. enzymes). However,
since selection for catalytic activity requires immobilized substrates and/or products,
selection for multiple turnover or maximum rate acceleration remains challenging.
To overcome these limitations a new method has been developed: Microfluidic-based
compartmentalisation of viral particles displaying single protein variants on their
surface. Encapsulation of these particles into picoliter drops allows the use of soluble
substrates/products and therefore the selection for multiple turnover. The model system
used here is based on retroviral particles displaying tPA (tissue plasminogen activator),
a protein used in current emergency therapies of myocardial infarction and stroke,
and a non-related control protein (neuraminidase, NA, inactive particles). Single
particles displaying tPA and NA variants were encapsulated into aqueous droplets and
the enzymatic activity was monitored using a fluorescence assay. Active variants could
be sorted from a mixture of active and inactive variants.
paprika.idref.fr
data.idref.fr
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