Note publique d'information : La cryoconservation de cortex ovarien est la seule technique envisageable pour les
patientes pré-pubères et les femmes dont la pathologie nécessite l’administration
d’un traitement hautement gonadotoxique dont l’initiation ne peut être différée. L’autotransplantation
est jusqu’à présent la seule méthode disponible de réutilisation du tissu ovarien
cryoconservé, et a permis d’obtenir plus de 130 naissances dans le monde, dont trois
au CHRU de Besançon. Toutefois, en cas de pathologie néoplasique à risque de localisation
métastatique ovarienne, cette technique peut présenter un risque de réintroduction
de cellules malignes susceptibles d’être présentes dans le greffon. Des méthodes alternatives
à l’autogreffe de tissu ovarien cryopréservé fondées sur l’utilisation de follicules
ovariens isolés sont actuellement en développement. L’objectif de cette thèse a été
de développer un protocole permettant l’isolement et la qualification de follicules
ovariens qui pourront être utilisés en thérapie cellulaire à usage humain. Dans un
premier temps, une validation de la technique d’isolement de follicules ovariens a
été réalisée à partir de la dissociation de fragments de cortex ovarien, issus de
patientes ayant subit une résection percœlioscopique, à l’aide d’une collagénase NB6
produite selon les bonnes pratiques de fabrication. Les follicules ainsi obtenus ont
été analysés en termes de viabilité (immédiate et après culture in vitro), rendement,
morphologie et état prolifératif. Dans un deuxième temps, la sécurité carcinologique
des suspensions folliculaires obtenues après isolement a été évaluée par cytométrie
en flux multicouleurs à l’aide d’une modélisation ayant consisté en la contamination
de suspensions folliculaires avec des cellules leucémiques issues de patients souffrant
de leucémies aigües myéloïdes (LAM) ou lymphoblastiques (LAL) d’immunophénotype connu.
La collagénase NB6 a permis l’isolement d’un grand nombre de follicules vivants, principalement
au stade primordial, et dont la majorité était non activée, même après trois jours
de culture in vitro dans un gel de fibrine. La technique d’isolement suivie de trois
lavages a permis d’éliminer les cellules leucémiques préalablement ajoutées aux suspensions
folliculaires dans 23 cas sur 24, sans endommager les follicules isolés. La cytométrie
en flux multicouleurs est une technique d’analyse efficace pour évaluer la contamination,
par des cellules leucémiques, de suspensions contenant des follicules ovariens isolés.
Le protocole d’isolement de follicules ovariens humains, ayant été réalisé avec la
collagénase NB6 de grade clinique, peut être envisagé pour une reconstruction ovarienne
à visée thérapeutique humaine.
Note publique d'information : The cryopreservation of ovarian cortex is the only technique available for prepubertal
girls and women when their pathology requires the administration of a highly gonadotoxic
treatment whose initiation cannot be delayed. Autotransplantation has so far been
the only available method to re-use cryopreserved ovarian tissue, and has resulted
in more than 130 births worldwide, including three at the Besançon Hospital. However,
in cases of neoplastic disease with a risk of ovarian metastatic localization, this
technique may present a risk of reintroducing malignant cells likely to be present
in the graft. Alternative methods to cryopreserved ovarian tissue autograft based
on the use of isolated ovarian follicles are currently under development. The aim
of this thesis was to develop a protocol allowing the isolation and the qualification
of ovarian follicles that can be used in cell therapy for human purposes. In a first
step, a validation of the technique to isolate ovarian follicles was carried out from
the dissociation of cortical ovarian fragments, taken from patients undergoing a laparoscopic
ovarian drilling, using collagenase NB6 which is produced according to good manufacturing
practices. Follicles thus obtained were analyzed in terms of viability (before and
after in vitro culture), yield, morphology and proliferative state. In a second step,
the carcinologic safety of follicular suspensions obtained after isolation was evaluated
by multicolor flow cytometry using a model involving the contamination of follicular
suspensions with leukemic cells from patients suffering from acute myeloid leukemia
(AML) or acute lymphoblastic leukemia (LAL) with known immunophenotype. Collagenase
NB6 has allowed the isolation of a large number of viable follicles, mostly at the
primordial stage and the majority of which were unactivated even after three days
of in vitro culture in a fibrin matrice. Our isolation technique followed by three
washes has allowed the elimination of leukemic cells previously added to follicular
suspensions, in 23 out of 24 cases, without damaging isolated follicles. Multicolor
flow cytometry is an effective analytical technique for assessing leukemic cell contamination
of suspensions containing isolated ovarian follicles. The protocol to isolate human
ovarian follicles, performed with the clinical grade collagenase NB6, may be considered
for an ovarian reconstruction to human therapeutic purposes.
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