Note publique d'information : Le but de cette étude a été la mise en œuvre d'un réacteur à enzyme immobilisée, à
activité alpha-amidante, à des fins de production en continu d'hormones peptidiques.
L'enzyme, la peptidylglycine alpha-amidating mono-oxygénase (PAM), étant une mono-oxygénase,
elle utilise l'oxygène moléculaire comme substrat, ainsi qu'un réducteur : l'acide
ascorbique. Dans ce cas, il y a formation dans le milieu réactionnel de molécules
toxiques par auto-oxydation de l'acide ascorbique. La première partie de notre travail
expérimental a été l'étude des phénomènes d'inactivation de la PAM au cours de sa
réaction. Nous montrons que la faible stabilité de l'enzyme est due à la présence
simultanée de l'oxygène moléculaire et de l'acide ascorbique. Afin de limiter cette
inactivation, nous avons cherché à ne pas simplement utiliser un système de protection
chimique ou biochimique. Nous montrons qu'une diminution de la quantité d'oxygène
dissout permet une stabilisation de l'enzyme. Tout au long de ces études, les nombreuses
analyses par HPLC nous ont permis de mettre en évidence la formation d'un intermédiaire
de réaction, stable, transformé enzymatiquement en peptide amidé. Dans la deuxième
partie de nos études expérimentales, nous avons voulu faire une approche non-exhaustive
de l'immobilisation de l'enzyme et de son comportement en réacteur. Nous montrons
la faisabilité de l'immobilisation de la PAM. D'autre part, quelques études préliminaires
en réacteurs avec la PAM immobilisée, nous ont permis d'appréhender le problème de
la diffusion de l'oxygène vers l'enzyme, ainsi que celui de la déstabilisation de
la PAM immobilisée en présence d'oxygène et d'acide ascorbique.
Note publique d'information : The goal of this study was to make use of an immobilized enzyme reactor, containing
alpha-amidating activity, to produce peptidic hormones continuously. As the enzyme,
peptidylglycine alpha-amidating mono-oxygenase (PAM), is a mono-oxygenase, it uses
molecular oxygen as a substrate, and a reductor, ascorbic acid. In this case, toxic
molecules are produced by auto-oxydation of ascorbic acid. The first part of our experimental
work was the study of the PAM inactivation during functioning. We show that the low
stability of the enzyme is due to the simultaneous presence of molecular oxygen and
ascorbic acid. We also show that decreasing of dissolved oxygen concentration allows
an enzyme stabilization. All along these studies, the numerous HPLC analyses have
allowed to show the formation of a reactional intermediate, stable, enzymaticaly transformed
in an amide peptide. In the second part of our experimental studies , we have chosen
to make a non-exhaustive approach of the enzyme immobilization and its performance
in open reactors. We show the feasability of the PAM immobilization. On the other
side, preliminary studies with immobilized PAM have allowed to apprehend the problem
of oxygen diffusion towards the enzyme and also those of the destabilization of immobilized
PAM with oxygen and ascorbique acid.
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