Note publique d'information : Connues pour leur forte teneur en acides gras polyinsaturés ω3, certaines espèces
de microalgues suscitent actuellement l’intérêt des chercheurs et des industriels.
Les enzymes lipolytiques, qui sont impliquées dans la mobilisation et le stockage
des acides gras, n’ont pas encore été caractérisées d’un point de vue structural et
fonctionnel chez les algues. Ce mémoire décrit l’isolement, l’analyse et le clonage
de 3 gènes codant une lipase et deux estérases hypothétiques chez la microalgue marine
Isochrysis galbana. L���analyse des marqueurs de séquences exprimées, édités dans
la banque EST d’Isochrysis galbana, a révélé l’existence de gènes incomplets susceptibles
de coder des enzymes lipolytiques. Après extraction des ARN totaux, purification et
rétrotranscription des ARN poly(A)+, 3 ADNc pleine-longueur ont été obtenus par amplification
rapide de leurs extrémités 5’ et 3’. L’analyse des séquences nucléotidiques a révélé
la présence de 3 phases ouvertes de lecture codant 3 protéines de poids moléculaires
théoriques équivalents à 49,06 kDa, 26,92 kDa et 24,88 kDa. Les études d’alignement
de séquences ont montré des similitudes avec des lipases et des estérases d’organismes
bactériens, fongiques, végétaux et animaux. Bien que de faibles taux d’identité (20
à 30 %) aient été observés, les 3 séquences contiennent la triade catalytique Ser/Asp/His
et le pentapeptide consensus Gly-X-Ser-X-Gly, 2 motifs hautement conservés chez les
enzymes de la superfamille des hydrolases à repliement α/β. Pour confirmer la fonction
lipolytique des protéines hypothétiques, une démarche expérimentale a été initiée
: les gènes ont été clonés dans un vecteur d’expression de levure.
Note publique d'information : Known for their high ω3 fatty acids contents, some microalgal species are currently
receiving much attention from scientific and industrials. Lipolytic enzymes from microalgae
involved in fatty acids mobilisation and storage have not been structurally and functionally
characterised. This work describes isolation, analyses and cloning of 3 complete gene
encoding one putative lipase and two putative esterases from the marine microalga
Isochrysis galbana. The EST database of Isochrysis galbana was searched for cDNA sequences
showing homology with lipolytic enzymes. Among the candidates genes identified, none
of them was found to be full-length. Total RNA extraction, poly(A)+ RNA purification,
reverse transcription, rapid amplifications of both 5’- and 3’- cDNA ends and nested
PCR were performed to obtain 3 complete coding sequences. Nucleotide sequence analyses
revealed 3 open reading frames encoding 3 proteins with a predicted molecular weight
of approximately 49,06 kDa, 26,92 kDa and 24,88 kDa. Databases were searched for a
global function expertise and results revealed similarities with lipases and esterases
from various organisms such as bacteria, fungi, plants and animals. Although those
three putative proteins shared low levels of amino acids identity (from 20 to 30 %),
they all enclosed two highly conserved patterns, the catalytic triad Ser/Asp/His and
the consensus pentapeptide Gly-X-Ser-X-Gly, found in enzymes of the α/β hydrolases
superfamily. To confirm the predicted lipolytic function, an experimental procedure
was introduced: genes were cloned in a yeast expression vector.
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