Note publique d'information : La maladie de Lesch-Nyhan (MLN) est une maladie rare dont la prévalence est estimée
à une naissance sur 380 000. Il s’agit d’une maladie métabolique d’origine génétique
liée au chromosome X, impliquant le gène de la HGPRT (hypoxanthine-guanine-phosphoribosyl-transférase).
Les mutations dans ce gène entrainent un déficit d’activité de l’enzyme qui joue un
rôle central dans le métabolisme des purines. Cette baisse d’activité provoque un
défaut de fonctionnement de la voie de recyclage des purines induisant l’accumulation
d’acide urique dans les articulations (goutte) et les reins (lithiase) qui peut être
contrôlée par la prise d’allopurinol. En revanche, ces symptômes sont généralement
accompagnés de troubles neurologiques quant à eux encore totalement inexpliqués et
non traités. Ces derniers se traduisent par un handicap moteur important avec des
mouvements anormaux (dystonie) et des troubles du tonus (hypotonie axiale). Dans les
cas les plus graves des troubles du comportement peuvent également survenir se manifestant
par des évènements importants d'automutilation (morsure des lèvres et des doigts).
Des études menées en imagerie cérébrale, ont permis d’identifier chez les malades
une diminution de la concentration cérébrale en dopamine mais aucune étude n’a encore
pu lier de façon évidente le déficit en dopamine et la HGPRT, rendant difficile le
développement de thérapies efficaces. L’objectif de ce travail a été de tirer avantage
des propriétés d’auto renouvellement et de pluripotence des cellules souches induites
à la pluripotence humaines (iPSC) pour produire d'authentiques neurones dopaminergiques
(nDA) puis de les utiliser afin de déterminer dans quelle mesure la HGPRT est essentielle
au développement et à l’homéostasie des nDA. Pour cela nous avons sélectionnés des
fibroblastes obtenus à partir de biopsie de peau d’enfants atteints par la MLN que
nous avons reprogrammé en iPSC. Ces iPSC ont été caractérisées et en particulier,
l’expression protéique et l’activité enzymatique de la HGPRT a été contrôlée afin
de valider notre modèle pathologique. Un protocole de différenciation de neurones
dopaminergiques à partir d’iPSC a ensuite été mis au point pour permettre l’étude
des différents stades de développement des neurones DA. Celui-ci permet d’obtenir
des précurseurs exprimant pour 60% des cellules les marqueurs caractéristiques des
précurseurs du mésencéphale ventral (MV), tout en respectant les différentes étapes
clés du développement des nDA. Après l’induction de la différenciation des précurseurs
en neurones, la population neuronale est composée d’au moins 20% de nDA exprimant
les deux enzymes de la voie de synthèse de la dopamine TH et AADC. Ces différentes
étapes du développement des nDA ont ensuite été analysées en comparant des cellules
porteuses de mutations associées à la MLN et des cellules contrôles. Une anomalie
neuro-développementale survenant à un stade précoce de la formation des nDA a été
identifiée. Lors de l’étape ultime de différenciation, la proportion de précurseurs
du MV capables de sortir du cycle cellulaire et donnant des neurones matures est plus
faible dans les cultures de cellules porteuses des mutations MLN. Cette étude a permis
dans un premier temps de démontrer qu’il était possible de modéliser une maladie impactant
un gène essentiel dans le métabolisme à l’aide des iPSC. De plus, nous avons montré
qu’il est possible d’identifier l’étape critique dans la genèse des nDA en utilisant
des neurones humains dérivés d’iPSC issus d’enfants atteints de MLN. Cette approche
apporte ainsi une meilleure compréhension sur les mécanismes responsables de la pathologie,
et de nouveaux axes de recherche pour des approches thérapeutiques.
Note publique d'information : Lesch-Nyhan disease (LND) is a rare genetic disease with a prevalence estimated to
1:380,000. LND is a metabolic Xchromosome linked disorder that essentially affects
boys and involves HGPRT gene (hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase). Mutations
in this gene result in a deficit of enzyme activity that plays a central role in the
metabolism of purines. This activity deficiency induces a dysfunction on purine recycling
pathway and promotes accumulation of uric acid in the joints (gout) and kidneys (stones)
controlled using allopurinol. Next to these metabolic symptoms are neurological disorders
which are not understood and efficiently controlled. These involve abnormal movements
(dystonia) and low tonus (axial hypotonia). A unique feature of LND is the occurrence
of self-injurious behaviors known as SIB (biting of lips and fingers). Brain imaging
studies have revealed in LND patient a decrease of cerebral dopamine concentration
but no study has yet been able to clearly link dopamine defect and HGPRT loss of activity,
making it difficult to develop effective therapies. The aim of my study was to take
advantage of the self-renewal and pluripotency properties of human induced pluripotent
stem cells (iPSC) to produce dopaminergic neurons (nDA), then to use them to determine
in which extend HGPRT is essential to the development and homeostasis of nDA. To that
purpose, we selected fibroblasts obtained from skin biopsies of LND children that
we have reprogrammed into iPSC. These iPSC were characterized and in particular, protein
expression and enzymatic activity of HGPRT was assessed to validate our pathological
model. We developed a protocol to differentiate dopaminergic neurons from iPSC to
allow the study of different stages of nDA development. It provides mature precursors
of nDA, expressing the typical marker of ventral midbrain (VM), while respecting the
different key stages of nDA development. Upon terminal differentiation, these precursors
produce at least 20% of nDA that express the two main enzymes of the dopamine synthesis
pathway, namely TH and AADC. These different stages of nDA development were analyzed
comparing LND and control IPSC. Neurodevelopmental abnormality occurring at an early
stage of nDA formation was identified. At the final stage of differentiation, the
proportion of MV precursors able to exit the cell cycle and differentiate as mature
neurons is lower in LND culture compared to controls. This study provided evidences
that it is possible to model a metabolic disease with iPSC and that they are essential
tools to study neurodevelopmental disorders. This approach provides a better understanding
of mechanisms responsible for the disease, and new research directions for therapeutic
approaches.
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