Note publique d'information : Parmi les dommages de l'ADN, la cassure double-brin (CDB) constitue la lésion la plus
toxique, puisqu'une seule CDB non réparée ou réparée de façon incorrecte peut conduire
à la mort cellulaire. Cette toxicité est justement exploitée en clinique pour éradiquer
les cellules tumorales. Parmi l'arsenal des molécules utilisées en chimiothérapie,
les poisons de topoisomérase I (TOPO1), tel que la camptothécine (CPT), sont capables
d'induire un type particulier de CDBs à une seule extrémité, générées lors de la collision
entre la fourche de réplication et la TOPO1 bloquée sur l'ADN. Ces cassures sont réparées
par recombinaison homologue (RH) puisqu'en absence de seconde extrémité, elles ne
peuvent être substrats de la jonction d'extrémités non homologues (JENH) qui, pour
ligaturer en nécessite deux. L'hétérodimère Ku, initiateur de la JENH est à la fois
un détecteur majeur des CDBs de par son abondance nucléaire et sa forte affinité,
et un puissant inhibiteur de la RH. Ainsi, pour la compréhension des mécanismes déterminants
le choix de la voie de réparation adaptée à chaque type de CBD, la régulation de la
liaison de Ku aux CDBs à une extrémité est donc une question cruciale. Dans ce contexte,
mon premier projet de thèse a concerné la compréhension moléculaire du choix de la
voie de réparation des CDBs à une extrémité. Par une technique de microscopie à haute
résolution, j'ai d'abord montré que l'hétérodimère Ku et son partenaire la DNA-PKcs
sont rapidement recrutés au niveau de ces dommages dans l'ADN de cellules humaines.
J'ai ensuite démontré que grâce à la phosphorylation de CtIP par ATM et à l'action
coordonnée des activités nucléases de MRE11 et CtIP, Ku est relargué des CDBs à une
extrémité. La dissociation de la DNA-PKcs des CDBs à une extrémité dépend de sa phosphorylation
par ATM au niveau du cluster ABCDE. A l'aide d'un mutant non phosphorylable de ce
cluster, j'ai montré que le défaut de dissociation de la DNA-PKcs prévient le relargage
de l'hétérodimère Ku dépendant de MRE11. Mes travaux suggèrent toutefois l'existence
d'une voie additionnelle pouvant éliminer Ku de plus 50% des CDBs à une extrémité.
Enfin, j'ai démontré que la persistance de Ku et de la DNA-PKcs aux extrémités de
la cassure ne perturbe ni la résection longue distance ni la formation de filament
de RAD51 mais compromet la survie cellulaire. Mon second projet de thèse a consisté
à perturber les mécanismes contrôlant le choix de la voie de réparation des CDBs dans
le but de potentialiser l'effet de la CPT. Comme l'inhibition d'ATM induit une sensibilisation
dramatique des cellules en réplication à la CPT, il devrait être possible d'identifier
d'autres sensibilisateurs à la CPT qui désorganiseraient la réparation des CDBs à
une extrémité. Sur la base d'un test de cytotoxicité, j'ai réalisé un criblage phénotypique
de la chimiothèque du NIH et identifié un antibiotique, la nitrofurantoïne (NTF) et
l'hydrocortisone acétate (HCA) capables de potentialiser l'effet de la CPT. Si la
sensibilisation par la NTF semble plutôt associée à la génération d'espèces oxygénées
réactives (ROS) par nitroréduction de la molécule, celle induite par l'HCA n'a pas
été reproduit et est toujours en cours d'investigation. Mes travaux de thèse contribuent
à la compréhension des mécanismes du choix de la voie de réparation impliqués dans
la tolérance des cellules à la CPT et ouvrent des perspectives de ciblage pour potentialiser
son pouvoir anti-cancéreux.
Note publique d'information : DNA double-strand break (DSB) is the most toxic DNA damage, because a single mis-
or un-repaired DSB can lead to cell death. This toxicity is exploited in clinics to
eradicate tumoral cells. So, among molecules currently used in chemotherapy, topoisomerase
1 (TOPO1) poisons such as camptothecin (CPT), are able to generate a particular type
of DSB bearing one single end (seDSBs); these lesions are created when a replication
fork collides with the TOPO1 blocked on the DNA. They are repaired by homologous recombination
(HR) because, devoid of a second end, they cannot be ligated by non-homologous end-joining
(NHEJ). The Ku heterodimer, the initiator of the NHEJ is both a major detector of
the DSBs due to its nuclear abundance and strong affinity, and a powerful HR inhibitor.
Therefore, the regulation of Ku binding to one-ended DSB is a crucial question for
the understanding of mechanisms determining the choice of the suitable DSB repair
pathway. In this context, my first thesis project aimed at deciphering the molecular
mechanisms responsible for the DNA repair pathway choice at seDSBs. Firstly, using
High Resolution Microscopy, I demonstrated that Ku and DNA-PKcs are rapidly recruited
on seDSBs. Then, I showed that ATM-dependent phosphorylation of CtIP and the epistatic
and coordinated actions of MRE11 and CtIP nuclease activities are required to limit
the stable loading of Ku on seDSBs. I established that DNA-PKcs removal from seDSBs
relies on ATM-dependent phosphorylation of the ABCDE cluster. Using a non-phosphorylable
mutant of this cluster, I demonstrated that impaired DNA-PKcs removal prevents MRE11
from releasing Ku. However, my work also suggested the existence of an additional
mechanism that contributes to prevent Ku accumulation at 50% of seDSBs. Finally, I
demonstrated that Ku and DNA-PKcs persistence on seDSBs does not impair long range
resection and RAD51 recruitment but compromises cell survival. My second thesis project
was dedicated to target the DSB repair pathway choice mechanisms in order to potentiate
the effect of CPT. Indeed, since ATM inhibition increases drastically the death of
replicative cells treated with CPT, we may identify others sensitizers able to disrupt
the repair pathway choice. On the basis of a cytotoxicity assay on mouse embryonic
fibroblasts (MEFs), I performed a phenotypic screening of the NIH Clinical Collection
and identified the antibiotic nitrofurantoin (NTF) and hydrocortisone acetate (HCA)
as a sensitizer of MEFs to CPT. However, sensitization induced by NTF does not depend
on Ku but rather seems to rely on Reactive Oxygen Species (ROS) generation by nitroreduction
of the molecule and sensitization induced by HCA is not reproducible and is still
under investigation. My work contributes to extend the knowledge of the repair pathway
choice mechanisms involved in cell tolerance to CPT and opens new opportunities to
potentiate its anticancerous property.
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