Note publique d'information : Les ribonucléases et les hélicases à ARN sont des acteurs clé du métabolisme des ARN
et jouent donc des rôles cruciaux pour la régulation de l'expression des gènes. Peu
de données sont connues concernant ce métabolisme chez les Archées, le troisième domaine
du vivant. L'équipe dans laquelle j'ai effectué mes travaux de thèse s'intéresse au
métabolisme de l'ARN chez les archées et plus particulièrement aux ribonucléases ß-CASP.
Dans ce contexte, nous focalisons nos études sur la compréhension physiologique que
pourrait jouer les ribonucléases ß-CASP aCPSF1 et aRNase J, orthologue respectivement
du facteur de terminaison de la transcription eucaryotes CPSF-73 et RNase J bactérienne.
Par analogie avec CPSF-73 et RNase J, qui font partie de complexes multi-protéiques,
des indices sur les fonctions des homologues archéens de ces ribonucléases pourraient
provenir de l'identification des complexes autour de aCPSF1 et aRNase J. Utilisant
des extraits de Pyrococcus abyssi et les protéines recombinantes aCPSF1 et aRNase
J comme appâts, nous avons identifié que aRNase J fait partie d'un réseau d'interaction
incluant une hélicase de la famille des Ski2-like (ASH-Ski2). En parallèle, des fractionnements
d'extrait de P. abyssi sur gradient de saccharose par ultracentrifugation indiquent
que aRNase J et ASH-Ski2 sont présentes toutes deux dans les fractions de haut poids
moléculaires avec les sous-unités du ribosome et ceux de l'exosome. Nous avons aussi
démontré une interaction stable entre aRNase J et ASH-Ski2 ainsi que des motifs impliquées
dans cette interaction par des expériences de co- purification par chromatographie
d'affinité. De plus, les caractérisations biochimiques de ASH-Ski2 indiquent que cette
protéine possède une activité d'hydrolyse de l'ATP dépendant de la présence d'acides
nucléiques. ASH-Ski2 possède de plus la capacité d'hybridation et de déroulement de
deux brins d'acides nucléiques en présence d'ATP. A notre connaissance, nos résultats
sont les premiers à indiquer un complexe contenant une ribonucléase et d'une hélicase
à ARN Ski2-like chez les archées. De manière intriguent, aRNase J est orthologue de
la RNase J bactérienne et ASH-Ski2 des hélicases Ski2-like des eucaryotes. Cela démontre
que les Archées pourraient posséder un système composite impliqué dans le métabolisme
des ARN partageant des caractéristiques bactériens et eucaryotes. Ces résultats mettent
en lumière l'avantage de l'étude des Archées pour la compréhension des mécanismes
moléculaires et évolutives des processus fondamentaux des trois domaines du vivant.
Note publique d'information : Ribonucleases and RNA helicases are the main actors of RNA processing and have a critical
role in gene expression regulation. Little is known about this process in Archaea.
Our group focuses in RNA metabolism in Archaea involving ß-CASP ribonucleases. Recently,
we published phylogenomic and experimental work demonstrating that archaeal ß-CASP
proteins, aCFSF1 and aRNase J, are highly conserved ribonucleases in Archaea. Archaeal
aCPSF1, an ortholog of the eukaryal transcription termination factor CPSF73, is ubiquitous
in Archaea suggesting an essential conserved function. Archaeal aRNase J, an ortholog
of the bacterial ribonuclease RNase J, is conserved through a major phylum of the
Archaea, the Euryarchaeota. These findings suggest that the role of these enzymes
in RNA processing can be reminiscent of ancient functions that had arisen early in
evolution. We now want to focus on understanding the physiological role of aCPSF1
and aRNase J with the hyperthermophilic euryarchaeal Pyrococcus abyssi as model. By
analogy to eukaryal CPSF73 and bacterial RNase J, which are part of multiprotein complexes,
clues to the function of the archaeal ß-CASP homologs might come from the identification
of archaeal multiprotein complex(es) containing aCPSF1 and aRNase J orthologs. Using
P. abyssi cell extracts and recombinant aCPSF1 or aRNase J as bait, we have found
that aRNase J is a part of protein interaction networks that include Ski2-like RNA
helicase (ASH-Ski2). In parallel, fractionation of P. abyssi whole cell extracts in
sucrose gradient by ultracentrifugation shows that aRNase J and ASH-Ski2 are present
in high sedimentation fractions with ribosomal and exosome sub-units. We also demonstrate
a direct interaction of aRNase J with ASH-Ski2 by co-purification affinity chromatography
experiments and identify motifs that potentially involve in this interaction. Biochemical
characterization of ASH-Ski2 demonstrates a nucleic dependant ATPase activity. ASH-Ski2
also possesses annealing and unwinding activities in presence of ATP. To our knowledge,
our results are the first experimental indications of interacting of a complex containing
ribonuclease and RNA helicase-like proteins in Archaea. Remarkably, aRNase J is an
orthologue of the bacterial RNase J and ASH-Ski2 is an orthologue of the eukaryotic
Ski2-like family proteins. This shows that Archaea might possess a composite RNA processing
system sharing both eukaryal and bacterial features. This highlights the advantage
of an archaeal model to gain further mechanistic and evolutionary information of fundamental
processes across the three domains of life.
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