Note publique d'information : Le clonage des ADN complémentaires codant pour les régions variables des immunoglobulines
est une étape incontournable pour la construction d'anticorps recombinants dont l'utilisation
dans les domaines biotechnologiques et thérapeutiques est en constante progression.
La particularité des "gènes" codant les chaînes lourdes et légères est qu'ils résultent
d'un réarrangement de différentes régions d'ADN spécifique d'un lymphocyte B. La grande
diversité générée par un grand nombre de gènes V, des étapes de recombinaison et de
mutations ponctuelles induitent lors du processus de différenciation du lymphocyte
B explique la difficulté de cloner ces ADNc par une étape de RT-PCR avec les amorces,
déjà décrites, localisées dans les FRI et FR4. Ce manuscrit décrit les différentes
stratégies que nous avons utilisé pour pouvoir affirmer que les séquences en acides
aminés déduites des ADNc obtenus sont bien identiques à celles de l'anticorps monoclonal.
La première approche, consistant à amplifier et exprimer directement (sous forme de
scFv) les régions variables par RT-PCR à l'aide d'un mélange d'amorces s'hybridant
dans les FRI et FR4, s'est révélée être un échec. Nous avons ensuite analysé systématiquement
les séquences des régions variables. Nous avons constaté que les amorces s'hybridant
dans le FRI et FR4 imposaient leur propres aminoacides. Afin de lever ces ambiguités
dans la composition en acides aminés, nous avons analysé la séquence de l'anticorps
monoclonal en générant une empreinte peptidique trypsique par spectre de masse. Finalement,
nous avons combiné, pour obtenir des séquences " certifiées" des régions variables,
une amplification des ADNc par RACE-PCR et une validation par une approche protéomique
associé à la reconnaissance par le scFv de l'antigène.
Note publique d'information : The efficient cloning of the cDNA encoding variable regions of Immunoglobulins is
the first hurdle that must be overcome if we are to develop 1 recombinant antibodies
of biological and therapeutic relevance. Moreover, characteristic of the domains coding
the heavy and light chains is that they result froID a rearrangement of various genes
(V -D-J-C) of specific DNA of B-cell. Besides, diversity generated by the large number
of V genes, Like recombination and specifics change induced during B-cell maturation
and differentiation process, highlights the difficulty of rcloning these cDNA by a
RT-PCR with described family specific primers. This manuscript describes Jour strategy,
used to confirm that the 1 ami no acid sequence deduced froID hybridoma cDNA, are
identical to those of monoclonal antibody investigated. The first approach consisting
of direct amplification of VL and VH chains by RT-PCR methodology and expression of
the corresponding single-chain antibody (ScFv). This i approach proved to by slow
and tedious, hindered further by the observation that the FRl and FR4 primers imposed
their own amino acids. ln Jaddition the aberrantly transcribed V-genes (from the fusion
partner) could be amplified by degenerated family specific primers in any given ,hybridoma
for each V-gene locus, in addition to the functionally rearranged allele imposing
additional technical difficulties. That why, it's was 1 necessary to identify the
correct rearranged clones. ln order to rai se these additional ambiguities, we amplified
the sequences by RACE-PCR, those,sequences were then analyzed systematically, by generating
a tryptic peptide map by MALDI-TOF mass spectrometer and peptide "fingerprint" or
protein databases searching for characterization of the corresponding sequence. Finally,
we combined amplification of cDNA by RACE-PCR and validation by a proteomic approach
associated with functional recognition by ScFv of the antigen to obtain "certified"
sequences of mobilized variable genes.
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